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冷凍干燥與液氮保藏菌種技術(shù)

更新時間:2019-10-26點(diǎn)擊次數(shù):1245

建議用下列方法恢復(fù)培養(yǎng)冷凍干燥保藏的菌種。

  一、安瓶管開封 :

  1.用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。

  2.用火焰將安瓿管頂端加熱。

  3.滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。

  4.用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。

  二、菌株恢復(fù)培養(yǎng) :

  1.用無菌吸管,吸取0.3~0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基,滴人安瓿管內(nèi),輕輕振蕩,使凍于菌體溶解呈懸浮狀。

  2.取0.1~0.2ml菌體懸浮液,移植于適宜的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上,剩余的菌液,注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi),然后在建議的溫度下培養(yǎng)。

  3.若未能活化,或活化后有疑問時,請于收到菌種1個月內(nèi),通知保藏中心,經(jīng)查證無誤后,即免費(fèi)補(bǔ)寄。

  三、注意事項 :

  1.菌種活化前,請將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。

  2.厭氧菌的培養(yǎng),如無特別說明,自開封至接種完成,均需以無氧氣體充填,以保持厭氧狀態(tài)。

  3.某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后,延遲期較長,需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長,此時請將步驟二(2)重復(fù)一次。

  < 液氮超低溫保藏程序 >

  1、容器的選擇:使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。

  2、檢查安培瓶是否滲漏:用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4℃浸泡30-45分鐘,沖洗干凈,棄去含有藍(lán)色染料的安培瓶,其余的安培瓶備用。

  3、打印標(biāo)簽(激光打印)。

  4、容器的滅菌:先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶,再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘,干燥并將打印好的標(biāo)簽放入安培瓶中,略擰緊螺旋蓋,再行121℃滅菌30分鐘。

  5、保藏菌菌齡:處于zui大生長量階段或?qū)?shù)生長期后期。

  6、保護(hù)劑:選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。

  1)甘油的準(zhǔn)備:在121℃滅菌15分鐘,2-8℃貯存。甘油一般以兩倍zui終所需濃度的水溶液保存,然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。若不用細(xì)胞懸液,則以zui終所需濃度的水溶液保存。

  2)二甲基亞砜:用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌。過濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。

  7、分裝:在無菌條件下,將細(xì)胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中,并注入保護(hù)劑,擰緊螺旋蓋。 傳代細(xì)胞

  8、將安培瓶固定在鋁夾上,貼好標(biāo)簽。為了便于取用,一般一個鋁夾上僅放一個菌株。

  9、將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃,再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃,然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后,將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中保存。

  10、菌種的復(fù)活:將液氮保藏的菌種取出,迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等*解凍后,再及時轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

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